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刺槐耐逆性家系及选育技术
1.成果内容概述
该成果属于国家攻关专题“三北地区抗逆性植物材料选育和培育技术”中独立子专题“刺槐杭逆性选育和改良技术研究”的初试成果，由北京林业大学森林资源与环境学院和三北防护林建设局北方荒漠林业实验研究中心等单位经4年努力共同完成。河南省经济林和林木种苗站、山东省林业科学研究院、宁夏林业科学研究所、甘肃省种苗站、辽宁省种苗站和辽宁省林业科学研究院等单位曾给予该项研究以大力支持，该成果亦汇聚了他们的贡献。
(一)刺槐抗逆性遗传材料的选择、收集和保存
(1)优良遗传材料的筛选、收集和优树选择
在对干旱地区刺槐资源状况进行了实地考察和调研相关科技成果基础上，根据表现型选择了16个无性系；根据早期遗传测定结果，在甘肃天水优良种源中选择了50个生长超过对照10%以上的优良半同胞家系；选择集了山东费县刺槐改良种子园生长超过当地对照15%以上的27个优良家系；选择收集辽宁锦县11个优良家系。
在干旱、盐碱立地条件下表现较好的刺槐植株，有枝下高较高，侧枝数多，侧枝长且粗，小枝密度、皮否则密度、皮孔密度等较大等特征。以生长和参考其他相关性状表现，在干旱地区的刺槐子代测定林中，选择了15个第二代优良单株；在干旱贫瘠逆境下，采用优势木对比法和主观对比法选择优树40株。
(2)遗传材料的保存
总共收集优良家系88个，无性系15个；选择优树40株，第二代优树15株。收集了家系种子和种根，在三北防护林建设局北方荒漠林业试验研究中心、北京林业大学苗圃建立收集圃育苗保存，现保存家系和无性系93份。
(二)田间对比试验和初选抗逆性系
半同胞家系和无性系在三北防护林建设局北方荒漠林业试验研究中心、北京林业大学苗圃开展苗期抗逆性和生长表现的对比试验。
(1)苗期家系生长状况对比
试验了不同来源家系138个，方差分析表明家系间极显著的遗传差异，苗高的家系遗传率为0.83左右，遗传选择有效。3年生试验家系中有8个的苗高超过当地优树子代，平均优势比为8%；地径优势比为15%。2年生中有9个家系苗高超过对照达15%以上；地径超过对照15%以上的家系有14个，T94超过对照达90%，表现非常突出。优良家系地径的较大生长优势，反映了其生长潜力。从家系来源看，山东费县家系表现最好，辽宁次之，甘肃天水第三。
(2)苗期家系生长与试验地点的交互作用
家系与试验地点间有显著交互作用，按两试验地点家系苗高生长表现排序，根据超过家系平镜一个标准差分级比较各家系生长的相对表，多数在全年干旱和盐碱较高的宁夏试验地表现好和较好的家系，在北京亦有好或较好有现，仅有家系T176除外，说明生长好的家系苗期在较差立地也可以有较好的生长表现。
(3)各家系苗木耐逆境能力田间对比
抗逆性试验地各家系苗木受害状主要表现为枯梢和枯干，它是苗木受干旱、寒冷、风害和盐碱综合影响的结果，亦是刺槐在西北地区发展的主要限制因子。采用加权法计算各家系枯梢率地平值，结果表明：苗木的适应性表现了极显著的遗传差异，3年生12个家系的受害系低于当地家系；2年生29个家系中有9个的受害低于当地对照(20%)。这为理一步的抗逆性选择介供了参考。
(4)家系受害状况与生长表现的相互关系
对家系生长与受害指数的相关分析结果表明，家系的苗高、地径与枯梢状况有显著的负相关，苗木成活率无显著耵关。相关分析结果使得选出抗逆性强且生长较好的优良家系成为可能。
(5)综合分析与优良家系初选
根据各家系的地径、苗高及枯梢率的相对表现，计算了选择指数，根据各家系的选择指数综合排序。以家系综合抗逆性能力高于当地对照，或与对照无显著差异；树高和地径的现实遗传增益平镜超过对照15%以上为标准。初选了优良家系14个，即T164、T94、B18、J11、T69、T176、74011、T169、J5、X207、T53、T108、T88和T82。其中家系T164、T94、B18和J11，不仅苗期的生长表现突出，而且受害率很低，表现了很好的早期综合抗逆性和优良的生长势，可以作为优良的抗逆性遗传材料进行区域化试验。
(三)刺槐抗旱、耐盐碱能力的测定技术和指标建立
(1)刺槐家系抗旱能力测定技术的综合研究
用人工似态试验方法对20个生长优良的家系的干旱胁迫研究结果表明：
①刺槐具有较强的抗旱性，在土壤含水量达到10%时就可以保持基本的生长；在土壤含水量低于7%时出现胁迫；在土壤含水量低于7%时出现胁迫；在土壤含水量低于3%时出现严重胁迫。
②各家系间叶片的厚度、栅栏组织厚和栅栏组织/海绵组织都存在显著遗传差异，家系遗伟力分别大到了0.95、0.96和0.89，对这些指标的遗传选择有效，进行家系内的选择也有一定潜力。
③各家系叶片的保水能力有显著差异，不同家系离体叶片的失水率不同，离体叶片失水率在离体1～10h内家系间变异最大，离体24h后叶片已基本达到恒重，因此，用失水率来鉴定刺槐家系叶片的保水力以离体1～10h内测定为好。
④叶绿素稳定指数(CSI)是较好的耐热性指标，经过高温处理后不同家系叶绿素稳定指数下降的幅度不同，它与家系的抗旱能力存在明显相关。
⑤根据刺槐家系在干旱拟态条件下苗木活力状态变化特点的研究，苗木活力与家系抗旱性有密切的正相关，苗木活力测定是反映苗木耐旱能力的较好方法，为进一步的家系和无性系耐旱能力评价打下了良好技术基础。
⑥叶组织含水量、叶饱和亏缺和叶水势随着水分胁迫强度下降，下降幅度在家系间有差异，下降的幅度越大，家系对水分胁迫反应越敏感，抗旱能力越差。家系间在水分参数和生理生化指标上都存在着差异，从而为家系抗旱性筛选提供了可能。
⑦叶水势、水分利用效率、净光合带率、蒸腾速率、电阻值在家系间有显著遗传差差异，家系遗传力均比较高，分别为0.81、0.87、0.85、0.85和0.74，可以用来作为刺槐家系抗旱性选择的依据。
⑧对水分胁迫下各生理生化指标之间的相关性都达到了极显著水平
⑨以叶保水能力、叶绿素稳定指标(CSI)、苗木电导率、叶水势、净光合速率(Pn)、蒸腾带率(Tr)和水分利用效率(WUE)这7个与抗旱性关系密切的指标建立刺槐家系抗旱性鉴定指标体系，利用这些指标可对刺槐家系的抗旱能力进行有效评价。
(2)刺槐耐盐生理基础与分子机制研究
对1年生刺槐家系苗进行不同浓度的盐处理，通过光合速率的测定、X射线微区分析、原子吸收、聚丙烯胺凝胶电泳等分析手段和技术，研究了盐胁迫对刺槐苗生长、光合及蒸腾作用的影响，盐胁迫对刺槐不同组织及细胞离子吸收和分配的影响、盐胁迫相关蛋白质等。
①在〉100mmol/LNaCl的胁迫处理下，刺槐家系苗木的生长开始受到抑制，50mmol/LNaCl处理的刺槐与对照相比，不但高生长、生物量、冠根比的增长没有受到抑制，反而有一定的促进作用，说明刺槐可耐受一定程度的盐环境。
②高盐胁迫引起刺槐净光合速率的下降与生长减绘的趋势是一致的，刺槐在不同盐胁迫浓度下，蒸腾速率的变化趋势基本一致。
③随盐浓度增大使细胞膜受到的损伤加剧，渗透调节的能力下降，生长受到抑制。
④盐胁迫下，刺槐体内Na＋含量随环境Na＋的增加而上升，根部的Na＋含量较高，其分布量的顺序是根〉茎〉叶，叶片中盐离子含量较低，从而减少了盐胁迫对地上部的毒害。
⑤植株体内的K＋在幼嫩的组织中分布较多，其分布量的顺序为叶〉茎〉根，叶中K＋含量是其他部位的3～4倍。盐胁迫下，刺槐中K＋含量随Na＋含量的增加而下降，表明Na＋的积累抑制了K＋的进入。
⑥刺槐叶肉细胞与根皮层细胞离子含量的测定结果表明：随NaCl胁迫程度的增加，Na＋和Cl-的含量在细胞壁、细胞质和液泡中都呈上升趋势。但在盐胁迫下，刺槐根皮层细胞的液泡中积累的Na＋和Cl-的量远高于细胞质，说明刺槐的根皮层对Na＋和Cl-具有一定的区隔化作用。
⑦无论是器官水平还是细胞水平的测定结果均表明，刺槐感的Na＋含量最高，说明刺槐吸收钠离子之后，可以将其保留在根部，以进行渗透调节。
⑧随盐浓度提高，气孔阻力上升，CO2补偿点、光补膛点升高，呼吸作用增强，盐肋迫状态下刺槐的高代谢活动超过一定限度则会严重影响正常生理活动，最终可导致苗木死亡。上述指标可以用于评价胁迫状态下刺槐的耐盐能力，并可根据不同盐浓度胁迫下苗木50%致死作为阈值，筛选耐盐家系。
⑨研究还发现，随盐胁迫处理时间的延长，刺槐实生苗有一定的适应反应；刺槐愈伤组织细胞，耐盐胁迫能力低于苗木。
(四)刺杭逆性改良的生物技术途径研究进展
建立了刺槐从外质体处理，愈伤组织诱导，脱化分和试管苗培育的刺槐组培再生技术体系，育出了组培苗，为进一步研究建立了培育技术；研究表明叶蛋白含量高于感蛋白含量；高盐胁迫降低了刺槐叶片和感蛋白的含量，说明过多的盐离子对刺槐的蛋白质合成系统造成了一定的伤害；在50mmol/LNaCl的盐环境处理下，增加了叶片中的蛋白质的含量，说明刺槐对盐胁迫有一定适应性反应；在植物耐盐性蛋白的分析研究基础上，初步探测到具有耐盐性的蛋白谱带。盐胁迫后，刺槐叶片中的58KD和33KD蛋白以及感的65KD、29KD蛋白人含量增加；而叶片中109KD和12KD蛋白的表达量降低。实验中33KD是新增加的蛋白带。
从藜科植物中克隆了与逆性相关的甜菜碱生物合成基因--胆碱合成酶和甜菜碱脱氢酶启动子基因，并已进行了DNA测序。
(五)良种繁殖园建设
在三北防护林建设局北方荒漠化林业试验研究中心，根据立地条件，采用完全随机区组设计，单株及申小区灵活设计建设良种园2hm2。包括山东、甘肃、宁夏及辽宁等地收集的刺槐优良家系和无性系55个。株行距为5m×6m。良种园的交通较便利。有灌溉条件。
2.成果关键技术、主要技术经济指标与国内外同类技术的比较
(一)关键技术
(1)刺槐抗逆性遗传材料的选择、收集和保存
在充分分析和调研基础上，选择、筛选并收集了159个在各地经济性状表现优良的刺槐家系、无性系和自选优树，异地保存93个家系、无性系。
(2)初选综合抗逆性表现优良的刺槐家系
在典型逆境的田间试验和多性状分析对比基础上，初选了综合抗逆性较强的优良家系14个：T164、T94、B18、J11、T69、T176、74011、T169、J5、X207、T53、T108、T88和T82，在受害程度低于对照或与对照无显著差异条件下，苗高和地径优势比平镜超过对照均在15%以上。家系T164、T94、B18和J11，受害率很低，苗期生长表现突出，具有很好的利用前景。
(3)研究了刺槐家系间抗旱能力变异的机理，建立了较为可靠地评价刺槐家系抗旱性的技术方法和指标体系
在水分胁迫状态下，家系对水分利用效率(WUE)反应类型的不同和差异是家系抗旱能力差异的主要原因之一。叶保水能力、叶绿素稳定指标(CSI)、苗木电导率、苗木活力指标、叶水势、净光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)和水分利用效率(WUE)8个与刺槐家系的抗旱性密切相关，利用这些指标可有效评价刺槐家系的抗旱能力。
(4)系统了解了刺槐抗盐性的生理基础，发现了盐胁迫状态下离子在刺槐组织和细胞微观结构上的区域化分布现象，建立了刺槐耐盐性评价和选择方法
全面分析和认识了刺槐的耐盐性机理，首次报道了盐离子在刺槐不同组织和细胞微管结构上的区域化分布，探讨了这种离子运动和分布状态对耐盐性的可能影响；建立起了刺槐耐盐碱能力测定的技术方法和指标体系，并有效进行了刺槐抗旱性和耐盐阈值的分析检测。
(5)检测发现了刺槐的盐胁迫诱导蛋白33KD，克隆了与抗逆性相关基因
在国内林业研究领域，自主克隆了与抗逆性相关的甜菜碱生物合成基因--胆碱合成酶和甜菜碱氢酶启动子基因，建立了相应的技术体系，并已进行了KNA测序。
(6)初建了刺槐抗逆性多功能初级良种园2hm2，提出了相应的建立和发展策略
(三)与国内外同类技术的比较
开展抗逆性植物材料选育技术的研究为国内首次专门立项启动的技术和技术基础研究领域，面临的技术问题均属国内林业技术研究的探索性内容，并具有国内的区域性特点，国外亦少有专门系统的研究报道。虽然借助的生理生化等分析技术手段多为经典技术，但针对一树木种内谱系的遗传特点开展的抗逆性评价和选育技术基础和实用技术研究，在国内尚属开拓性工作，整体成果水平应处于国内同类研究的领先地位。采用的研究技术处于国际当前研究相同水平，研究成果的系统性上处于国际同类研究的先进水平。
【完成人】李悦蒋湘宁杜和平王沙生陈雪梅薛玉玮张术忠李国锋王艳青刘颖高森王平
【完成单位】北京林业大学三北防护林建设局北方荒漠林业实验研究中心
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