葡萄卷叶病毒病研究发展

2011/1/20 15:41:23

葡萄卷叶病毒病分布广﹑危害大，在北京﹑河北﹑天津﹑山东及宁夏地区均有发生，在酿酒葡萄上表现尤其严重，染病植株果实的品质和产量都明显降低，直接影响到葡萄酒的质量。现宁夏地区，在优良酿酒葡萄品种“蛇龙珠”上发现有严重的卷叶病毒病，导致果实的含糖量明显下降，含酸量则上升。
1病状﹑传播方式﹑发病和经济危害
1.1症状
　　葡萄卷叶病具有半潜隐性，在大部分生长季节不表现症状，多数欧亚种病株在果实成熟阶段表现症状，在采收到落叶前叶片症状最明显。其症状因品种﹑时间﹑环境条件及年份而不同。典型的特征是先从基部叶片开始，叶缘向下反卷，并逐渐向其它叶子扩展。通常，反卷的叶片变的纸脆，叶脉间出现坏死斑或叶片干枯。红色品种在秋季前叶片先变成淡红色，随着秋季深入，病叶呈暗红色，仅叶脉呈绿色[1-3]；白色品种叶片卷缩而不变红，但是叶脉间稍有褪绿，病株果穗变小，果粒颜色变黄变暗，含糖量降低，成熟晚，病株叶片部位的钾镁钙含量低于健康叶，而叶柄部位的含量较高。该病毒发生在果蒂穗梗﹑枝条和叶柄的韧皮部，叶子薄壁细胞和半胞的筛管发生堵塞和坏死。
1.2传播方式
葡萄卷叶病主要是通过枝芽无性繁殖和带毒砧木嫁接进行传播，除GLRaV-3外，其它都没有自然传播介体。目前认为有5种粉蚧可以传播GLRaV-3，分别是榕臀纹粉蚧（planococcusficus）﹑桔臀纹粉蚧（P.citri）﹑拟长尾粉蚧（pseudococcusaffinis）﹑柑橘栖粉蚧（P.calceolariae）和长尾粉蚧（P.longispinus）。另外，棉蚧（PulvinariavitisL）也可能是它的一个介体。Calbalaleiro通过ELISA研究粉蚧（Planococuscitri）传播GLRaV-3的特点，结果表明：经带毒粉蚧传染后，仅在1/10的植株中检测到GLRaV-3,80%以上的粉蚧在传毒后1h内失去传毒能力，而在新感病的葡萄植株中病毒具有潜隐性，至少在13个月内ELISA检测不到。Pe.tersen和Charles用拟长尾粉蚧和柑橘栖粉蚧的第1和第3龄做传毒实验，结果表明这2种粉蚧只有第1龄可以传毒。另外，Belli报道桦树棉蚧可以传播GLRaV-3。Habili等通过狭线印迹杂交和ELISA检测，分析了葡萄品种黑品诺在行内相邻葡萄间的自然传毒特点，推测GLRaV-3可能靠移动很慢的介体传毒[2-3]。
1.3发病情况
葡萄卷叶病分布极广，凡有葡萄栽培的地区都有卷叶病毒病的存在。在辽宁兴城﹑山东青岛﹑天津﹑宁夏等葡萄产区均有发生[4-5]。宁夏玉泉营地区葡萄圃内的50多个品种和砧木的卷叶病自然发病情况的调查研究表明：在美洲种群﹑东亚种群中没有发现卷叶病症状，欧亚种群卷叶病症状的品种比例最高，且程度严重；欧美杂种﹑欧山杂种均有表现卷叶病毒的品种，但发病率﹑严重程度低于欧亚种；欧亚种中，以鲜食品种为主的东方品种群比以酿酒品种为主的西欧和黑海品种群卷叶病发病率低；其中，在酿酒葡萄品种中卷叶病最严重的品种有：白诗南﹑品丽珠﹑梅鹿辄﹑蛇龙珠﹑白玉霓﹑赤霞珠﹑哥海娜﹑黑比诺[5]。
1.4经济危害
葡萄感染卷叶病以后，其叶片中的叶绿素含量﹑光合速率都明显低于健康品种，导致后期经济产量的降低，株产量比对照减少近4倍左右，同时病株浆果含糖量偏低，而酸度上升，直接影响了酿酒葡萄的品质。其中酿酒葡萄品种“蛇龙珠”的病株与正常植株相比，结果枝数﹑结果系数﹑果穗数﹑穗重﹑单果粒重和株产都明显降低，还原糖含量低10g/L左右，总酸含量则高3g/L左右[6]。
2病原
葡萄卷叶病毒属是从原有的长线病毒属中分离出的一个植物病毒属，2002年7月由ICTV核准。本属病毒粒子长度大于1000nm，通常为1400~2200nm。包含一个线状﹑正单链RNA分子，大小为16.9~19.5kb。其CP（外壳蛋白）亚基的分子量大，为35~39kDa。葡萄卷叶病相关病毒GLRaV-3为本属的典型种，基因组大小为16.9~19.5kb,CP(外壳蛋白)大小为35~37kDa,CPd通常定位在CP基因的下游，由伪介壳虫和粉蚧传毒[7]。
自20世纪80年代首次报道葡萄卷叶相关病毒GLRaV-1以来，至少已确立了9种名命为葡萄卷叶相关病毒的病毒病（GLRaV-1到GLRaV-9）。GLRaV-9是2002年在美国加利福尼亚首次报道[7]，随后在澳大利亚的部分葡萄品种上也观察到。
3检测技术
目前葡萄病毒的检测使用最广泛的是指示植物法和血清学方法，分子生物学检测（PCR检测技术）已有报道，但还未应用于生产中的大批量检测。葡萄卷叶病毒没有草本寄主，只有木本寄主植物，检测所需的时间长[3，7]。
3.1血清学检测
ELISA检测在葡萄卷叶病毒上应用较普遍，但是测试的阴性不能作出无病毒的结论，仍需要指示植物嫁接鉴定后才能确定。目前，ELISA可检测出葡萄衰退病﹑GLRaV-1到GLRaV-8﹑GVA﹑GVB﹑GVC﹑GVD和GRSPaV。我国蔡文启等采用几种间接异种动物抗体双夹心法和PAS-ELISA，成功地从葡萄园感病植株及组培苗木中测定了GLRaVs[8]。单克隆抗体大大提高了ELISA的可靠性，已制成了GFKV﹑GLRaV-1﹑GLRaV-2﹑GLRaV-6﹑GLRaV-8和GVD的单克隆抗体和GRSPaV的多克隆抗体。对同一种病毒能用PCR-ELISA检测，不仅能增加检测的灵敏度，而且还能降低检测成本。在商品试剂盒中，阳性对照材料是用感病植物材料制成的，存在着植物健康方面的风险，用克隆抗原会克服这些问题[9]。
葡萄卷叶病血清学检测的方法有DAS-ELISA（抗夹心-ELISA）﹑PTA-ELISA（间接-ELISA）和PAS-ELISA（A蛋白夹心-ELISA）检测。DAS-ELISA能缩短检测时间，提高工作效率，特别是检测大量样品时优势更大，然而这项技术具有较高的株系特异性，在检测中可能产生假阴性反应，必要时可以用PTA-ELISA和PAS-ELISA对一些关键样品进行复检[10]。用DAS-ELISA检测葡叶病毒病，植株下部幼嫩组织是最适的检测部位[11]。PAS-ELISA(A蛋白夹心-ELISA)检测在脱毒组培苗检测中有应用[10]。
3.2分子生物学检测
聚合酶链式反应（Polymeraschinareaction,PCR），即无细胞克隆，是美国Cetus公司人类遗传学研究室科学家KaryB.Mulli在1985年发明的一种快速的特定DNA片段体外扩增法。
葡萄卷叶病的检测是提取材料中的总RNA或dsRNA，经反转录获得cDNA来作为模板进行特定DNA片段体外扩增，再进行琼脂糖凝胶电泳。国际上RT-PCR成功的应用于GLRaV-1﹑GLRaV-2﹑GLRav-3﹑GLRaV-4﹑GLRaV-5﹑GLRaV-6﹑GLRaV-7检测；分子杂交以应用于GLRaV-1﹑GLRaV-2﹑GLRaV-3[7]。
国内有关葡萄卷叶病毒IC-RT-PCR和RT-PCR检测已有报道。有报道RT-PCR扩增的片段序列与病毒源序列的同源性高达99.3%，说明RT-PCR法检测葡萄卷叶病毒GLRaV-3结果可靠[12]，但该技术存在提取总RNA（其他物质影响）和dsRNA（含量少）困难，牛建新[13]等对RNA和dsRNA的提取方法进行了研究，筛选出了适合的方法。陈建军[14]等对DAS-ELISA﹑RT-PCR和IC-RT-PCR检测葡萄卷叶病毒GLRaV-3的效果进行比较研究表明：RT-PCR在GLRaV-3的检测中不稳定，受到环境﹑实验仪器﹑实验员身上的RNA酶的影响，以及植物组织中其他植物（蛋白质﹑DNA﹑多糖等）等污染，提取完整纯化的RNA非常困难，增加了实验难度，并且直接影响了检测结果；而IC-RT-PCR不用提取RNA，弥补了RT-PCR的不足，使得检测更为简便﹑快速。但对于病毒含量低的样品的检测，RT-PCR是一种比较好的检测方法，其灵敏性随着病毒含量的增加而增加。不论带症状与不带症状的品种，选用韧皮部作为实验材料，3种方法均可检测出GLRaV-3。对叶片的检测结果则不一，对于带症的品种，RT-PCR和IC-RT-PCR对上﹑中﹑下部的叶片都检测到了病毒。对于不带症的品种，中部叶片，秋季IC-RT-PCR的检出率为100%。牛建新[13-15]等在GLRaV-3的RT-PCR的有效体系的基础上，通过对RT-PCR主要成分对RT-PCR的影响，确立了葡萄卷叶病毒的RT-PCR的优化体系和多重RT-PCR检测优化体系，用于同时检测GFLV和GLRaV-3。
4脱毒技术
4.1葡萄卷叶病毒病脱出的方法
　　微茎尖培养﹑微茎尖结合药剂处理﹑微茎尖结合热处理（盆栽原材料热处理和试管苗热处理）3种方法在脱出葡萄卷叶病毒上都有应用，目前微茎尖结合热处理（试管苗热处理）效果较好。顾沛雯[16]等实验表明微茎尖结合热处理（试管苗热处理）的脱毒率和成活率都高于微茎尖培养﹑微茎尖结合药剂处理﹑微茎尖结合热处理（原材料热处理），即保证了脱毒率又保证了成活率。微茎尖结合热处理（盆栽原材料热处理），变温处理比恒温处理脱毒率相差不大，但成活率要明显提高。
4.2基因转导
　　欧洲国家（如奥地利﹑法国﹑意大利﹑瑞士），以色列及美国首先注意到一些葡萄病毒病毒是通过线虫和粉蚧传染的，已将GLRaV-2和GLRaV-3外壳蛋白基因导入到沙地葡萄品种和其它砧木中。通过转基因进行遗传转化，获得了对病毒产生抗性的植株，目前仍在试验阶段。
（摘自《中外葡萄与葡萄酒》） （宁夏大学葡萄工程技术研究中心，银川 750021） 作者：李玉霞，王振平，奚强

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