毛白杨离体繁殖技术

2011/1/18 12:00:43

毛白杨属杨柳科杨属，是我国特有树种，树干通直，高大，适应性强，生长快，是用材林和城乡绿化的优良树种，其优株的无性系苗木，生长速度比普通毛白杨快15%～20%，经济价值更高。但用常规无性繁殖时，如扦插、压条等，很难生根，加之繁殖材料有限，不仅用材多，费工费时，而且成活率低，繁殖系数不大，很难在短期内繁殖大量苗木。试管快繁对于毛白杨来说，无论在理论上和生产实践上均具有重要的意义。目前，毛白杨的试管快繁技术已在造林育苗的生产实践中推广应用。我们用植物组织培养法进行毛白杨的快速繁殖，在短时间内收到了良好的效果。
1外植体的选择与灭菌
1.1外植体脱毒
选择品种优良、健壮的植株进行盆栽，温度逐渐提高到35～38℃。在这温度下培养2个月，这期间要注意肥水的管理，以减轻高温处理造成的死苗现象。剥取茎尖和腋芽。切取顶芽或腋芽3cm左右大小，去掉叶片，保留护嫩叶柄。用清水反复冲洗干净。用70%的洒精浸10s，用无菌水冲洗3次。0.1%氯化汞浸5min倒出后用无菌水冲洗3～5次。取出用滤纸进行吸干。在解剖镜下，将材料置于无菌的滤纸上，剥嫩苞叶，露出锥形体，切取0.5mm长度的茎尖，带有2个叶原基，迅速接种到培养基上，防止茎尖脱水再要注意的一点是不要倒置。
茎尖剥离的大小是脱毒效果的关键技术。茎尖剥离越小，脱除病毒的效果越好，但接种不易成活；茎尖剥离得越大，接种成活越高，但脱除病毒的效果差。结合热处理进行茎尖培养，操作简便，容易掌握，脱除病毒的效果好。
1.2休眠芽的外植体的选择与灭菌
毛白杨在初代培养时也可以采用休眠芽作为外植体，取当年形成的直径在5mm左右健康无病虫害的枝条，用解剖刀切成长度为1.5～2.0cm的节段，每个节段带休眠芽。
将切段先用自来水冲洗干净，再用70%～75%酒精浸泡30s同时不断用玻璃棒搅动，目的是能够使外植体的表面能够充分与酒精接触进行消毒。倒掉酒精后，立即用无菌水冲洗3～5遍，冲洗去残留的酒精。然后用5%的次氯酸钠溶液或用0.1%氯化汞溶液进行浸泡7～8min，倒掉这些消毒液，再用无菌水冲洗3～5遍。在无菌操作台上将外植体取出放在已灭好菌的滤纸上吸去残留的水分，放在另一张已灭菌的滤纸上进行切割成带有1个叶芽的茎段。
1.3叶片外植体的选择与灭菌
毛白杨在初代培养时也可以采用叶片做为外植体。
将叶片先用自来水冲洗干净，再用70%～75%酒精浸泡10s同时不断用玻璃棒搅动，目的是能够使外植体的表面能够充分与酒精接触进行消毒。倒掉酒精后，立即用无菌水冲洗3～5遍，冲洗去残留的酒精。然后用5%的次氯酸钠溶液或用0.1%氯化汞溶液进行浸泡7～8min，倒掉这些消毒液，再用无菌水冲洗3～5遍。在无菌操作台上将外植体取出放在已灭好菌的滤纸上吸去残留的水分，放在另一张已灭菌的滤纸上将叶片切成5mm×5mm。
2外植体的接种
2.1操作人员需着经灭菌物白色工作服，戴口罩。进行人接种室前，工作人员的双手必须进行灭菌，用肥皂水充分洗涤，操作前再用70%的酒精擦洗双手。
2.2操作期间经常用70%的酒精擦拭双手和台面。特别注意防止“双重传递”的污染。
2.3在打开培养瓶、三角瓶或试管时，最大的污染危险是管口边沿沾染的微生物落入管内。解决这个问题，可在打开前用火焰烧瓶口。
2.4工具用后及时灭菌，避免交叉污染。
2.5由于空气中有灰尘，因此在操作时，仍要注意避免灰尘的落入。尽量把盖子盖好，当打开瓶子或试管时，应在酒精灯前与水平面成45°角，右手将已切割好的外植体用镊子放在培养基中（但是外植体不夹的过紧或过松），之后将瓶盖在火焰上烧一下盖上即可。
3培养基的成分
预培养所用的培养基的成分是：MS＋0.5mg/LBA＋100mg/L水解乳蛋白，经1周的观察将没有被污染的外植体转接正式诱导分化的培养基：MS＋0.5mg/LKT＋0.02mg/LNAA＋100mg/L赖氨酸＋3%蔗糖。培养室的温度在25～27℃，日光灯连续照射16h，光强为15001x左右；经1个月培养茎段（茎尖大约在2～3个月）可以分化出芽，愈伤培养基：MS＋0.2mg/LBA＋0.02mg/LNAA＋100mg/L将叶片放在愈伤培养基上进行愈伤的诱导，产生后将其愈伤组织放在分化培养基上进行分化培养。壮苗培养基为：1/2MS＋1.5%蔗糖；两周左右培养，即可长成带有4～5个叶健壮的无根小植株。生根培养基为：1/2MS＋0.2mg/LIBA＋0.02mg/LNAA＋3%活性炭＋1.5%蔗糖；12h的光照与黑暗交替；光强为1500lx经1个月左右培养，即可长成带有6～7个叶健壮完整小植株。
4扩大繁殖
4.1茎切段生芽扩大繁殖法
将由茎尖（茎段）诱导出的幼芽从基部切下，转接到新配制的壮苗培养基上。壮苗培养基为1/2MS＋1.5%蔗糖。经1个月左右培养，即可长成带有4～5个叶健壮的小植株。将小苗进行切割成带有叶的茎段再次分别插入分化培养基中如此反复循环即可获得大批的无根苗。这时将这些无根苗分别插入生根培养基中进行生根。
4.2叶切块生芽扩大繁殖法
每片叶从基部中脉处切取1cm×1cm并带有约0.5cm长叶柄的叶切块，转接到分化培养基上进行培养，注意的是要将叶的被面贴在培养基上。可从叶柄的切口处观察到有芽出现。之后逐渐增多成簇。每个叶切块可得20余个丛芽。将这些芽切下，转入生根培养基中可得到完整的小植株。
5诱芽的影响因素
5.1不同无机盐浓度的影响
不同无机盐浓度的对比试验，采用MS和1/2MS大量元素两种浓度。对比结果，以高浓度的无机盐对诱芽的效果为好，在低盐浓度的培养基上芽的诱导率几乎减少一半。
5.2不同激素水平的影响
进行了3种激素水平的对比试验，KT用量全同，只NAA的用量不同。从添加NAA0.002mg/L处理看，诱芽率皆低，只NAA的用量加大到NAA0.02mg/L时，则表现最好，当NAA0.1mg/L时则诱芽率又都有下降的趋势。
5.3不同培养瓶的诱芽情况
从100ml三角瓶和500ml广口瓶的诱芽对比试验看，经1个月培养，广口瓶诱芽情况大大优于三角瓶，芽数几乎多1倍。
5.4不同途径培养对比
以0.5mm长的茎尖培养得到大量正常的植株，在添加一些生长素等物质。表面具有分生能力的愈伤组织，重复继代培养仍可保持植株再生能力。大大超过传统的方法，且比用诱导侧芽的方法也高得多。
6移栽与管理
6.1嫩茎试管生根
切取3cm左右试管苗无根嫩茎，转插到1/2MS＋NAA（IBA）0.1～0.5mg/L培养基上，经7～10d即可达到生根率80%，12d生根率可达100%。在无植物生长物质的培养基上，生根率90%～100%。
6.2无根嫩茎的扦插
将试管苗无根嫩茎切段，直接扦插到介质中生根。切段基部经生根粉处理，2周后生根率达90%。免去试管生根的这一环节，降低了成本，缩短生产时间，提高了生产效率。
试管苗生根后，连瓶苗一起放入室，以适应光照和温湿度。3～5d后，打开瓶口取出试管苗，按一定株行距置于细砂或粗蛭石介质中，加盖拱棚覆膜保持温度和湿度。5d后逐渐揭膜见光，及时通风换气，定期喷肥和喷药，防止有菌类的污染，提高试管苗的成活率。

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