植物愈伤组织培养

2011/6/13 8:41:47

一、原理
植物组织培养是指在无菌条件下，对离体植物组织（器官或细胞）分离并在培养基中培养，使其能够继续生长，甚至分化发育成一完整的植株的一门实验技术。组织培养的理论依据是植物细胞的全能性，即植物体的每个细胞携带着一套完整的基因组，因此具有发育成完整植株的潜在能力。植物组织当中原本已经分化的细胞，一旦脱离原有的机体环境，成为离体状态，在适宜的营养和外界条件下，就会表现出全能性，从已经分化定型的细胞，脱分化，成为恢复分裂能力的细胞，并能重新生长发育成完整的植株。
愈伤组织是指一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化不断分裂、增生子细胞，这些细胞胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明，逐渐形成了无序结构的一团细胞。
二、试剂及仪器
（一）仪器设备
超净工作台、高压灭菌锅、微波炉、人工气候箱、电子天平、移液器（1-5ml）、恒温磁力搅拌器、酸度计、手术刀、手术剪、称量纸、皮筋、封口膜、三角烧瓶（500ml、100ml）、量筒、烧杯（1000ml）、试剂瓶（1000ml、100ml）、长镊子、记号笔（或标签纸）、培养皿、酒精灯、打孔器
（二）试剂
75% 酒精、次氯酸钠（或H2O2）、植物生长激素、蔗糖、脂粉、HCl、NaOH、KH2PO4、CoCl2?6H2O、烟酸、盐酸-硫胺素（VB1）、盐酸-吡哆醇（VB6）、肌醇、甘氨酸
三、实验步骤
（一） 培养基配制
1. 培养基的选择
植物组织培养中应用的培养基，一般由无机营养物、碳源、维生素、生长调节剂和有机附加物等五类物质组成。
无机营养物包括大量元素和微量元素。大量元素：C、H、O、N、P、S、K、Ca、Na、Mg等，微量元素：Mn、Zn、Cu、B、Mo、Fe等。碳源一般为蔗糖。 维生素中只有硫胺素是必需的，而烟酸、维生素B6和肌醇对生长之起促进作用。常用的生长调节剂有IAA （吲哚乙酸）、IBA（吲哚-3-丁酸）、 NAA（萘乙酸）、NOA（萘氧乙酸）、 P-CPA（对氯苯氧乙酸）、2，4-D（二氯苯氧乙酸）、2，4，5-T（三氯苯氧乙酸）；BA P（苄氨基嘌呤）、6-BA（苄基腺嘌呤）、2-Zi（异戊烯氨基嘌呤）、 KT（激动素)等。有机附加物是指甘氨酸、水解酪蛋白、椰子乳等，可促进分化，但如培养基配方适当，则大多数组织是不需要的。
培养基的种类、成份直接影响到培养材料的生长发育，故应根据培养植物的种类和部位，选择适宜的培养基。培养基种类繁多，最基本、最常用的培养基为MS培养基（见表1）。
2. 培养基的配制
① 先按表1配制MS培养基贮液，②再将贮液与其他成分按比例混合。③ 此外还需加入适量的蔗糖作为碳源，起支持作用的琼脂粉，适量的生长调节剂等。④ 将上述培养基加热溶解后，加蒸馏水使培养基达到终体积。⑤ 再用0.1mol/L NaOH 或0.1mol/L HCl 调节培养基的pH值至最适。⑥ 分装至三角烧瓶，封口膜封口，等待灭菌后使用。
3. 几种诱导愈伤组织的培养基
胡萝卜MS+0.5mg/L 6BA + 0.5mg/L NAA
玫瑰叶盘，芽 MS+0.5mg/L 6BA + 0.5mg/L NAA
烟草叶盘、叶柄 MS+0.1mg/L 6BA + 0.5mg/L NAA
pH 5.8，蔗糖30%，琼脂粉6.5g/L。
（二）灭菌
1．培养基及器具灭菌培养基、无菌水需要在高压灭菌锅中灭菌。灭菌作用取决于温度，常用的灭菌温度为121℃，所需时间应随要灭菌的液体的容积变化而变化（见表2）灭菌结束后待温度下降到50℃以下，才能取出已灭菌的培养基。
可用同样方法对器具同时进行灭菌，包括：培养皿、解剖刀、剪子、滤纸、镊子、打孔器等。
2．工作环境灭菌
接种前1ｈ打开超净工作台和棚面的紫外灯照射40min。杀菌结束后，先关掉棚面的紫外灯，再打开风机，最后关掉超净工作台上的紫外灯。在接种后休息时，要先打开台面的紫外灯，再关风机，最后打开棚面紫外灯。不能将风机与台面上的紫外灯同时关闭或先关闭风机再开紫外灯。
3 . 植物材料的灭菌
植株各部分的表面携带着各种微生物，他们是植物组培的污染源，所以在接种培养前必须进行彻底的表面消毒；组织内部侵染的真菌或细菌很难消除，这些组织一般淘汰不用。消毒前需用流水清洗植物材料表面污垢，再用无菌洁净滤纸吸干水分。
植物材料的灭菌需在超净工作台内进行，可选择不同的灭菌剂进行植物组织表面消毒（见表3）。同时注意，表面消毒剂对植物组织也是有毒的。因此，应当选择消毒剂的浓度和时间，尽量减少组织的死亡。灭菌后，需用无菌水反复冲洗，彻底洗去表面消毒剂。
如：胡萝卜储藏根消毒：将胡萝卜用洗涤灵清洗，擦干，切段。进超净工作台后，先用75%酒精擦洗切段，擦干后，在2%次氯酸钠中浸泡5秒钟，用无菌水冲洗10 次，无菌滤纸吸干，用灭过菌的打孔器取材。准备工作就绪后，可以进行接种。
（三）接种
1. 进台
工作人员进入接种室前，需要洗净手和手腕。进入超净工作台内需用75%酒精纱布擦拭手、手腕，再擦培养基瓶和超净工作台。
2. 接种
(1) 剪、镊消毒：接种前剪、镊应插入75%酒精瓶中，取出后置于酒精灯外焰上彻底灼烧，灼烧时应将剪口、镊口张开，烧至剪、镊上火焰熄灭为止，冷却后方可进行接种。接种后仍需灼烧并插回75%酒精的磨口瓶待用。注意每次取出时剪口并拢，不可接触磨口瓶和其它器皿，并保持尖端向下。
(2) 插植外植体：左手拿三角瓶，解开封口膜，将三角瓶几乎水平拿着，靠近酒精灯焰，将瓶口外部在酒精灯火焰上燎数秒钟，使瓶口的水气散发掉。用右手拇指、食指、中指拿消毒过的镊子夹一块外植体送入瓶内轻轻的插入培养基上，镊子灼烧后放回磨口瓶，再把封口膜在酒精灯火焰上燎数秒，灼燎时应旋转，避免烧坏，盖好封口膜，扎紧皮筋，便完成了第一瓶的操作，接着再做第二瓶，如此直到外植体全部接完。
3 注意事项
(1) 操作人员的头、胳膊等不得进入台内；
(2) 操作人员不得随意谈话、说笑，以免造成污染；
(3) 用酒精对双手消毒时，务必待酒精彻底挥发后再靠近酒精灯火焰，以免火焰伤手；
(4) 台外人员走动要轻、动作要小。
（四） 培养
接种或继代培养的植物组织置于人工气候箱中培养，温度25±2℃，适当光照强度和光周期。每4-6周继代一次。培养过程如果有的培养物被微生物污染，应当马上将其清理，以免影响其它培养物。

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