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组培方法
植物组织培养（Plant Tissue Culture），是植物组织和细胞培养的简称，又叫植物体细胞遗传学或植物克隆，是基因工程的一个环节，生物工程的重要组成部分。植物组织培养不涉及到基因的遗传重组，所以克隆出的植物与其源植物具有完全相同的遗传背景，因此克隆植物的性状较一致。另外对一些通过种子繁殖较困难或后代产生重大分离的物种而言，组织培养技术更实用。同时这种技术具有植物生长周期短、节省空间、不受环境季节影响等许多优势。
组织培养一般分为五个步骤：
1）培养基的配制
培养基的成份随植物的种类、外植体的类型、培养阶段的不同而不同。一般来说，培养基应含有大量元素、微量元素、铁盐、维生素、激素、糖和琼脂等物质，有时还在培养基中添加有机附加物，如活性炭、椰子汁等。培养基的配制按如下步骤进行：
（1）根据培养材料确定培养基。一般可先试用MS培养基，若不适，再改用其它培养基。
附：MS培养基——A组：（大量元素）（单位：mg·L-1，下同）
NH4NO3 1650 ；KNO3 900 ；CaCl2 440 ；MgSO4·7H2O 370；KH2PO4 170
B组：（微量元素）
KI 0.83 ；H3BO3 6.2 ；MnSO4·H2O 22.3 ； ZnSO4·7H2O 10.6
C组：
Na2MoO4·2H2O 0.25 ；CuSO4·5H2O 0.025? ； CoCl2·6H2O 0.025
D组：
EDTA 37.3? ； FeSO4·7H2O 27.8
E组：（有机物）
甘氨酸（C2H5NO2） 2.0 ； 盐酸硫胺素（VB6） 0.1 ； 烟酸 0.5
吲哚乙酸（VB1） 1-30 ； 盐酸吡哆醇 0.5 ； 6-苄基氨基腺嘌呤（6-BA） 0.04-10 ； IAA（吲哚乙酸） 0.01-3
其他溶液的配制：1mol/L的NaOH溶液，0.1mg/mL的6-BA溶液，0.1mg/mL的IAA溶液，0.1mg/mL的2,4-D溶液，0.1mg/mL的KT溶液，0.1mg/Ml的ZT溶液。
（2）按照确定的培养基配方配制培养基，一般包括溶化琼脂、加入蔗糖和母液、调整酸碱度、定容、分装等步骤。
（3）对分装好的培养基进行高压灭菌，将灭菌好的培养基放入接种室中。
2）无菌培养物的建立
（1）外植体的切取及消毒。用于快速繁殖的外植体可以是种子、茎尖、叶片、花序等。外植体必须先进行消毒，其消毒方法是：从植株上切取所需的部分，用水冲洗干净，而后移入超净工作台中用消毒剂（次氯酸钠、氯化汞、酒精等）进行消毒，但不管使用什么消毒剂，消毒后的外植体应该是无菌的，而其本身没有被消毒剂杀死。
（2）将消毒后的外植体接种到培养基中，接种时要求迅速准确，防止交叉污染。
3）中间繁殖体的诱导和增殖
消毒后的外植体在培养基上培养一段时间后可诱导出从芽、胚状体、原球茎、根状茎，这些培养材料称为中间繁殖体。对中间繁殖体进行切割、继代培养就可以进行中间繁殖体的增殖。中间繁殖体的增殖速度随花卉的种类、培养基、培养条件的不同而异，因而对具体花卉需进行试验，找到合适的繁殖条件，以达到“快繁”的目的。
4）生芽、壮苗与生根
当中间繁殖体增殖到一定数量后快速繁殖进入生芽、壮苗和生根阶段。如果是通过从芽繁殖，则不需经过生芽直接进行壮苗、生根，如果是通过其它途径则需先将中间繁殖体转移到生芽培养基上，然后再转移到壮苗生根培养基上。在壮苗生根培养基上，大多数花卉要分离成单苗。
5）试管苗移栽和管理
对已经生根的试管苗及时移栽是花卉快繁的最后工作，而且也是十分关键的工作。由于试管苗是在无菌、有营养供给、适合光照、温度和100%相对湿度环境中生长的，因而刚出瓶的试管苗对外面环境不太适应，稍一不慎便会造成大量死苗。所以对刚出瓶的试管苗要给予特别的照顾，适当的温度、弱光照、高的空气湿度、适宜的基质及对病虫害的有效控制是提高成活率的关键。
影响组织培养的因素
因素大致可归结为三大类，即外植体、培养基成份和培养条件。
1）外植体是影响成功的一个重要因素。适宜的外植体应根据植物种类确定，不仅要考虑到获得外植体的材料来源、器官和组织的类型，同时还需要考虑外植体的大小、生理年龄等。外植体可以是植株上的任何一部份，主要应用的有幼叶、茎尖分生组织、种子、鳞茎、球茎、根茎、花序、茎段等。选取的外植体必须易于消毒，在适宜的培养基上起动率高。
2）培养基是影响成功与否和效率的关键因素。培养基组成的各成份，矿物盐、糖的浓度、维生素、铁盐、激素和有机附加物都会对快繁过程产生影响，其中以激素类物质影响最大。培养基成份应根据植物的种类、外植体的类别和阶段来确定。在最初的外植体培养中使用较高浓度的生长素或细胞分裂素，在继代培养中激素浓度可适当降低。生芽阶段使用细胞分裂素的浓度高而在生根阶段使用生长素浓度高等。
3）培养条件是影响成功的另一个关键因素。培养条件一般包括温度、光照、气体状况等，培养条件同样依不同的植物、不同的培养阶段而不同。就温度而言，大多数培养的植物组织20～28℃即可满足生长所需，其中26～27℃最适合，但也有不少例外。其次是光照，在初代培养一般需要一段时间暗培养，继代繁殖散射光即可，而在生根状苗阶段则需要强光才能形成芽和根。渗透压与植物组织的生长和分化很有关系。在培养基中添加食盐、蔗糖、甘露醇和乙二醇等物质可以调整渗透压。通常1～2个大气压可促进植物组织生长，2个大气压以上时，出现生长障碍，6个大气压时植物组织即无法生存。一般植物组织生长的最适宜pH为5～6.5。在培养过程中pH可发生变化，加进磷酸氢盐或二氢盐，可起稳定作用。
污染问题
污染问题是组织培养过程中常见的而且也必须给予高度重视的一个问题。污染率达20％很常见，有时甚至高达50％。经分析，组织中的污染来源可分成三大类：第一类是材料带菌，第二类是接种污染，第三类是培养过程感染。材料带菌就是选用的外植体因过大等原因本身带有病菌，或继代培养的材料本身带有病菌。针对这种情况，要求初代接种时使用大小适宜的外植体，在继代的培养中，每次继代之前都要对继代的材料进行仔细检查，凡是污染的材料应予以丢弃。接种污染是由于在接种过程中将病菌传入培养材料而造成的。引起接种污染可能有三个原因：第一是由于超净工作台滤出的空气中带菌超标造成的，属于这种情况要及时修理或更换超净工作台；第二是由于交叉污染造成的，针对这种情况，要求接种者操作细心，接种用的镊子不要与酒精灯、台面等接触，一旦接触应立即进行消毒处理，同时各瓶材料接完时要对镊子进行消毒；第三种是由接种者呼吸等原因造成的，针对这一点，要求接种者在接种时应用酒精棉擦手，穿上无菌的白大衣，带上口罩和帽子。
在材料培养的过程中，如果环境中病菌多、湿度大、温度高，同样会使培养的材料污染。这就要求我们要经常进行清洁卫生，对培养空间定期进行消毒处理，及时清除污染材料，转移继代材料。
有时候高压灭菌不彻底，会造成严重污染，这点也很关键。
褐变问题
组织培养中的一大问题是初代培养中外植体易于褐变。从我们的经验和别人研究结果看可采取以下方法：①初代培养时，剥取组织块最好能够在无菌水中进行；②初代培养采用液体培养比用固体培养效果好；③在培养基中单独或复合使用防褐变物质：芸香苷50-100毫克/升、20%硫代硫酸钠溶液5毫升/升、柠檬酸0.05-0.5%、活性炭1-4克/升、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）5-10克/升；④从开始培养到成活的一段时间内保持摄氏温度17-20度；⑤调整好培养基的酸碱度，以酸碱度为5.5时成活率高；⑥6-8月份高温季节，外植体易褐变，成活率低；⑦从新生的假球茎上取芽，不仅能够减少污染，而且成活率高。
无菌苗移栽
如何创造适宜的移栽条件，提高无菌苗移栽成活率呢？有研究表明，首先，要保持试管苗的水分供需平衡，要达到这一目的，一是要增加空气湿度，减少叶面蒸发；二是要注意介质湿度的控制，促进尽早发根，增加水分吸收。第二要选择适宜的介质，并对介质进行灭菌处理。介质是影响试管苗成活率的又一个重要因素，疏松通气、适宜的保水性、清洁卫生是移栽试管苗对介质的基本要素。常用的介质有蛭石、珍珠岩、粘沙、谷壳、锯木屑、磨菇渣等，将这些介质根据需要按一定的比例混合，然后经过灭菌处理即可供移栽使用，这样的介质既可保水又利于通气，因而有助于根的成活。第三要防止杂菌兹生。为了防止菌类兹生，除要求对移栽试管苗的基质消毒外，另外两种措施可以保护幼苗不受或少受病毒浸害，一是在试管苗刚移出时，用0.1%的高锰酸钾或一定浓度的新洁尔灭溶液浸苗，另一种则是在幼苗移栽扣定期喷洒一定浓度的杀菌剂，如百菌清、多菌灭、托布津等，浓度以1/800～1/1000为宜。可以结合喷施叶面肥进行。第四，光温要适中。刚移出的试管苗要求光线弱，而成活后则要求光照强些，同时光照的弱强随植物种类而异，观叶植物一般要求遮光。
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