银杏树愈伤组织培养概述

2013/6/30 14:42:02

银杏是目前地球上最原始的裸子植物之一，是新生代第四纪冰川期的孑遗植物，素有“活化石”之称的银杏现仅存一科一属一种，它原产于我国，具有及其重要的科学研究意义和药用开发价值。银杏细胞中含有黄酮类和内酯类物质，对心脑血管疾病疗效显著。利用银杏组织培养技术可以生产这些物质起治疗和预防的作用。自20世纪90年代以来，一些学者开始对银杏的胚、茎端和配子体等组织培养。近年来，细胞悬浮培养得到了广泛的研究，本文章综述了国内外银杏组织培养的研究现状并对其工业应用前景进行了顧。
一、 银杏愈伤组织培养
(一胚培养
夕卜植体的来源及其发育阶段对胚发生意义重大。一般对于胚来说，子叶、胚珠、胚等，都是较理想的外植体。选取实验材料时不宜选取新生的种子，这样的种子胚过嫩过小，不宜剥离，应采用颗粒饱满、未发生霉变且诱导率高的成熟种子。胚的消毒常常采用70%的酒精消毒2～3分钟，再放人0.1%升汞溶液中减压灭囷20分钟左右，再用无囷水漂洗3～5次，然后用刀片挑出胚，将胚整体或切成两段后用灭菌滤纸吸干水分，即可用来接种。对于胚的离体培养，常常采用MS和N6培养基作为基本培养基。若用于诱导胚芽生长，贝何向培养基中添加一定浓度的NAA或BA；若用于诱导生根，则常向培养基中添加适量得2，4-D。此外，少量的还原氮如0.1mmol/LNH4CD即可明显的促进胚状体的生成。
(二茎培养
剪除银杏枝条的叶片和叶柄，用漂白粉和升汞溶液进行灭菌，经无菌水漂洗后，从芽上切取长约0.5cm的茎尖，进行接种。接种的培养基采用改良的White培养基：White+BA0.5—1.0mg/L+NAA0.5mg/L+NH4Cl5.34mg/L+白糖4%。光照对于愈伤组织的形成有抑制作用，可以对材料进行一周的暗处理，在转移至自然光下促进茎的分化。银杏茎段的组织培养取得一些突破，有人通过银杏茎段的离体组织培养已得到了丛生芽，但数量极较少。另外，活性炭、改良MS培养基和多效唑等都可以促进腋芽萌动和分化。
三配子体培养
也有不少人尝试用银杏花粉作为材料进行离体培养。银杏花粉细胞具有银杏的全套遗传物质，腿迄今为止尚无成功利用银杏花粉诱导出完整银杏幼苗的报道。Laumh等和陈学森等做了银杏花粉和雌配子体原生质体分离与培养实验，该实验虽未获得完整再生植株，但是Lauras等在进行对银杏花粉原生质体培养的过程中，首次诱导出处于不同时期的胚状体，是银杏配子体培养的一个重大突破。原生质体培养仍是大部分+对木再生植株的难题，花粉的发育受不同因素影响，由配子得到完整银杏植株目前只存在理论的可能性，所以银杏配子体得培养仍是一个未攻克的雜。
二、银杏愈伤组织的诱导
不同银杏外组织的诱导能力有区别，其诱导率由高到低是子叶、叶片、茎段。银杏愈伤组织诱导及生长状况也与培养基、激素以及无机盐含量有关。例如：茎的最适培养基为N6培养基；叶及叶柄最适培养基为B5培养基;改良的MS培养基对叶、胚、叶柄和茎愈伤组织的诱导具有显著效果，而根在各种培养基上的诱导效果都不理想。此外，激素对于愈伤组织的诱导也有重要影响：2，4-D诱导能力强，细胞老化速度快；激素NAA活性不高，诱导力弱；NAA与6-BA按一定浓度配合使用，最适合于诱导幼叶分化出愈伤组织，而2，4-D、KT和KT与6-BA组合，不能使银杏幼叶产生愈伤组织或者诱导率很低。另外，高压静电处理和添加椰汁或琼月脂糖等也被证明有利用愈伤组织的诱导。
三、银杏愈伤组织培养的利用
㈠银杏组织培养代替传统方法生产银杏黄酮和内酯
银杏细胞含有黄酮和内酯物质，具有潜在的药用价值。试验证明，银杏叶提取物对血管扩张，加速血液循环，降低血压效果显著。目前市场上的黄酮化合物多是从银杏叶片中提取，易受到地理、气候等因素的限制。此外，而内酯和黄酮化合物在银杏细胞中含量较低，加上银杏栽培占用大量耕^地，种种因素导致黄酮的产量供不应求，价格居高不下。所以通过银杏愈伤组织培养生产内酯及黄酮化合物具有广阔的前景，其优势在于不受季节和地域影响、产量高、成本低、周期短，并且能多进行自动化控制。
二利用发根农杆菌遗传转化生产银杏黄酮和银杏内酯
虽然银杏愈伤组织培养技术已经趋近成熟，但离体分化过程难以控制，至今尚未有建立起完善的再生培养体系，所以针对银杏遗传转化研究课题较为单一，难度也较大。目前对银杏遗传转化的报道都是利用一些菌株，如发根农杆菌通过遗传转化生产银杏黄酮化合物和内酯，此方'法现已发展成为继细胞培养技术之后的又一新的培养技术。Laurain等首次利舰侵染胚实验，成功进行了发根培养，证明了银杏组织培养过程中产生银杏内酯。随后，张伦等利用不同的发根农杆菌菌株：R15834，R1000和A4，对银杏幼叶、芽和茎端进行转化，除A4外，均能诱导获得了毛状根，并检测到农杆菌Ri质粒的部分遗传物质已整合到银杏细胞的基因组中。实验证明通过发根农杆菌进行基因转化是可能的，但毛状根培养系统的建立至今尚未成功。
四、 银杏愈伤组织培养的发展前景
银杏植株物种价值高，用途广泛。如今心脑血管疾病成为人类健康的一大隐患，而利用银杏组织生产促进血液循环的银杏黄酮类化合物、银杏内酯等次生物质的生产上也就越細受到重视。此外，银杏繁殖能力差，如何利用体外离体组织培养对银杏这一古老的裸子植物就行快速的繁殖也是一个研究课题。当然银杏细胞培养也存在一系列问题，如细胞褐化现象，未建立完整的再生体系以及遗传转化困难等。总的说来，银杏细胞培养为内酯和黄酮化合物的生产以及银杏这一古老植物的傲户提供了一种经济而有效的途径。

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