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杜仲的繁育技术--组织培养
杜仲的繁育技术
杜仲的繁育技术包括内容比较多，大致包括以下六个部分：播种繁育，扦插繁育，根蘖繁育，嫁接育苗，压条繁育和杜仲的组织培养。
(六)杜仲的组织培养
1985年以来，先后有不少学者对杜仲进行了组织培养快速繁殖方面的研究。所取外植体有杜仲的种胚、茎尖及叶芽等。其培养方法一般选用固体培养基，它的主要成分可以分为水、无机盐、有机化合物、天然复合物、培养基的支持材料等5大类，有时还要添加抗生素及中药等其他物质。培养基的种类很多，它是组织培养中最重要的基质。选择合适的培养基对培养成功与否关系甚大。杜仲的组织培养一般选用MS(Mura— shige。和Skoog)培养基。现以MS培养基为例，说明培养基的成分、制备过程及外植体的消毒方法和杜仲芽培养形成完整植株等。
1．培养基的主要成分
(1)水
培养基大部分是水。配制培养基时一般用蒸馏水 或重蒸馏水(蒸馏水再蒸馏1次)，使水中不含或少含某些离子，保证培养基中成分完全人为控制。
(2)无机盐
即是氮、磷、钾、钙、镁、硫等元素。其中氮是培养基中大量需要的。在MS培养基中，以铵态氮的含量为主。磷是生物必需的一种元素，也是作为能源ATP合成所不可缺少的，培养基中以磷酸根(P02—)的形式添加，另外钾、钙、镁、硫等元素，也是植物生长所必需的，这些元素缺乏会产生缺素症，影响酶的活性和代谢。
(3)微量元素
微量元素是植物生命活动不可缺少的。如铁在合成叶绿素中起重要作用，是植物生长不可缺少的金属元素，缺铁影响到胚的发育，阻碍子叶变绿。铁盐(Fe(SO4)2和FeCl2)在氢离子浓度6309nmol／L以下(ph5.2以上)常成Fe(OH)2的不溶性沉淀，所以常用以FeS04·7H20和Na2-EDTA结合成的螯合铁。此外，锰、铜、钼、锌等是植物生长所需要的微量元素，MS培养基中经常使用。
(4)有机化合物
①碳水化合物(糖)碳源
植物在光合作用中，产生糖类，不必另外给糖。在组织培养中，大多数情况不能产生光合作用，必须在培养基中加糖，作为碳源。同时糖的浓度对调节培养基的渗透压有一定作用。培养基中使用最普遍的是蔗糖，浓度为2～3％。
②植物激素
是植物生命活动中不可缺少的物质，它能促进细胞的分裂生长及诱导器官的分化。组织培养中应用较多的有吲哚乙酸(IAA)；吲哚丁酸(1BA)、萘乙酸(NAA)、2，4—二氯萘氧乙酸(2，4-D)、6—苄基氨基嘌呤(BA)等。
③维生素
是植物组织培养中经常使用的，有维生素B1(盐酸硫胺素)、维生素B6(盐酸砒哆醇)、生物素、烟酸、叶酸等，使用浓度一般为0.1～0.5毫克／升。
④肌醇
对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用，对细胞壁的形成也有促进作用，还可以增强愈伤组织的生长。使用浓度一般为100毫克／升。
(5)培养基的支持物在MS培养基中，使用最普遍的凝固剂是琼脂。加入琼脂后，可使液体培养基成为固体培养基。常用量为0.5～l％。加得太多，则培养基过硬，使培养材料不能很好的与培养基结合，易使材料干燥枯死；用量太少，则培养基太软，使材料在培养基中不稳定，甚至下沉被培养基淹没而死。
2．培养基的制备过程
(1)母液及激素的配制和保存 培养基需经常配制，为了减少工作量和便于低温贮藏，一般配成比所需浓度高10～100倍的母液，配制培养基时只要按比例量取用即可。母液的配制是按所使用药品的类别，分别配成大量元素； 微量元素和维生素的高浓度液体。配制母液时要注意有的无机成分在一起时，可能产生的化学反应，如溶解后会产生沉淀，就不能配在一起作母液贮存，应分别配制和保存。配制母液要用蒸馏水等纯度较高的水。药品要用等级较高的化学纯或分析纯级的，药品的称量及定溶都要准确。各种药品先加少量水让其充分溶解，然后依次混合。MS培养基，根据各药品的特点，母液可配成以下几种：
①大量元素母液： 1000毫升(10倍液)
CaCl2·2H20 440毫克／升 称取 4400毫克
KNO3 1900毫克／升 称取 19000毫克
MgS04·7H20 370毫克／升 称取 3700毫克
NH4NO3 1650毫克／升 称取 16500毫克
KH2PO3 170毫克／升 称取 1700毫克
每配制培养基1000毫升，可取母液100毫升。 ③铁盐母液：500 毫升(100倍液)
FeS04·7H2O 27.8毫克／升 称取 1390毫克
Na2-EDTA·2H2O 37.3毫克／升 称取 1865毫克
每配制培养基1000毫升，取母液10毫升。
②微量元素母液：500毫升（100倍液)
MnSO4：4H20 22.3毫克／升 称取 1115毫克
ZnSO4：·7H2O 8.6毫克／升 称取 430毫克
H3BO3(H2BO2） 6.2 毫克／升 称取 310毫克
KI 0.83毫克／升 称取 41.5毫克
CuSO4·5H20 0.025毫克／升 称取 1.25毫克
Na2M04·2H20 0.25毫克／升 称取 12.5毫克
CoCl·6H2O 0.25毫克／升 称取 12.5毫克
每配制培养基J000毫升，取母液10毫升。 ④有机生长物质(成分)：500毫升100倍液)
甘氨酸 2毫克／升 称取 100毫克
盐酸硫胺素 0.4毫克／升 称取 20毫克
盐酸吡哆素(醇) 0.5毫克／升 称取 25毫克
烟酸 0.5毫克／升 称取 25毫克
肌醇 100毫克／升 称取 5000毫克
每配制培养基1000毫升，取母液10毫升。如用量少时，上述②、③、④号母液也可各配制100毫升；如用量多时，①号母液可配制5000毫升。
⑤激素的配制(即生长调节物质)：
常用的激素有IAA、NBA、BA、Zt(玉米素)等。在实验室配制的浓度一般为0.1毫克／毫升或5毫克／毫升。配制方法是：称取5毫克的溶质 (即所需激素)定溶于50毫升的蒸馏水中，便得到0.1毫克／毫升的溶液。称取50毫克的溶质，定溶于100毫升的蒸馏水中，便得到0.5毫克／毫升的溶液。配制好的母液及生长调节物质(激素)的瓶上要分别贴标签，注明母液及激素的名称、配制倍数(或浓度入配制日期及配l升培养基时应取的量，然后可贮存在冰箱里备用，冰箱温度可调至1～4℃。在低愠下，可以保存几个月，如发现霉菌和产生沉淀就不能使用。
(2)培养基的制备
分为培养基的配制、氢离子浓度(酸碱度)的调整，及培养基的分装、消毒灭菌等步骤。配制培养基时要预先作好各种准备。首先是将贮存的母液及所用激素按顺序排好，再准备好所需的各种玻璃器皿、量筒、烧杯、吸管、玻棒、漏斗等，放在固定的地方，便于使用。称好所需的琼脂、蔗糖。准备好蒸馏水及培养瓶(一般用50～100毫升的三角瓶)、盖瓶的棉塞、包纸、橡皮等。琼脂比较难溶解，应先放于烧杯或其他器皿中加入所需体积1／2的蒸馏水，加温搅拌使之溶解。琼脂溶解后，再加入蔗糖，然后按母液顺序，依母液浓度量取规定的量依次倒入量筒中，混合均匀，倒入已经溶解的琼脂中，继续搅拌，再加蒸馏水定溶到所需体积；经过用pH试纸对氢离子浓度进行调整，氢离子浓度达到1585nmol／L(pH5.8)，趁热分装，装入50～100毫升的三角瓶中，盖上棉塞，包纸后用橡皮筋捆扎，并在包纸上写上培养基的名称或代号。当天必须进行消毒、灭菌。这样，MS培养基就配制完毕，放在低温干净的条件下贮存备用。一般可以保存 2周到1个月。
MS培养基是植物组织培养中用得最多的基本培养基。根据培养不同植物的需要，还要加入不同量的；不同浓度和不同种类的激素，以促进植物细胞的分化与生根。加入激素的方法是：在配制MS培养基过程中，加蒸馏水定溶到所需体积时，先不调整氢离子浓度。经过计算，将需加入的激素按一定量的浓度配比用吸管吸入；再滴入所需体积酌MS培养基中，充分搅拌后再调整氢离子浓度。然后分装、消毒、灭菌。
调整氢离子浓度一般在消毒灭菌前进行；使氢离子浓度保持在1000～3981nmol/L(pH5.4～6)为好，过高或过低都会影响到琼脂培养基的凝固。培养基分装时要掌握好分装量，太多浪费培养基，而且缩小了培养材料的生长空间，太少影响生长，一般占试管、三角瓶等培养容器的1／4～1／3为宜。分装应趁热进行，不要把培养基沾到管壁上；以免招致杂菌的危害，分装后马上塞上棉塞加上盖子。
培养基的消毒、灭菌，一般采用高压蒸气锅蒸10～20分钟。在培养基消毒、灭菌时，可把接种植物材料用的蒸馏水盛入三角瓶中，用棉塞塞紧，牛皮纸包裹瓶口，再用橡皮筋捆扎，将镊子、剪刀、刀子等用具用布垫包裹或放入铝制饭盒中，与培养基一起放入高压锅中消毒。培养基消毒后取出放入搪瓷盘中，将盘子放入平坦的桌面上，让培养基冷却、凝固。为了证明消毒、灭菌成功，可以将培养基放到培养室进行3天预培养，若无污染反应，可以使用。放入低温干净的容器内贮存。量少时放入0～4℃的冰箱里，贮存时间最长，培养基配制过程中，所用的玻璃器皿要洗涤干净，不能带有杂质。试管、三角瓶、玻璃器皿等可先用清水冲洗，再浸入洗衣粉液中浸泡，用刷子内外刷洗，冲净，再用蒸馏水冲洗1～2次，可以放入150℃的烘箱中，干热灭菌1小时后备用，也可以倒立于实验台上，待水分滴于后放入干净容器中备用。吸管、量筒等难以洗涤的要先放入洗液中浸泡两小时，再用清水冲洗.
3．外植体的消毒
消毒的目的是为了消灭病菌，保证无菌组织培养的顺利进行。但从不同植物材料及不同部位所取的外植体的特点不同，要进行摸索试验，以达到最佳的消毒效果，既能消灭培养材料上的病菌，而又不损伤或只轻微损伤组织材料，不致影响其外植体的生长。常用的消毒剂有漂白粉(1～10％的滤液)、次氯酸钠液(0.5～10％)、氯化汞(0.1～1％)、酒精(70％)等。
消毒外植体前先用自来水冲洗外植体l0～15分钟。然后按照不同器官的外植体，在超净台上按一定顺序进行消毒。例如杜仲的种胚作外植体，接种前将种子用自来水冲洗10分钟，在超净台上再用70％的酒精对种子进行表面消毒，然后用经消毒、灭菌的培养皿、镊子、刀子等用具，将白色的种胚取出，放入10％的次氯酸钠溶液中，消毒10～15分钟，再用无菌水冲洗3次，便可接种于备好的培养基中。
4．杜仲芽培养形成完整植株
湖南省农科院原子能农业应用研究所的张朝成先生，1988年用杜仲芽培养形成了完整植株。现将其培养方法介绍如下：
从生长健壮的杜仲成龄树上，取下当年生幼枝，除去叶片，经自来水流水冲洗(将幼枝剪成带有2～3个腋芽的茎段，放入烧杯，盖上纱布，用橡皮筋固定烧杯口上的纱布)10～20分钟，再转入超净工作台进行无菌操作。先将冲洗好的茎段用70％的酒精表面消毒3分钟左右，再用0.1％升汞液消毒9分钟，无菌水冲洗3～4次，然后用消毒工具，切取带芽的茎段，接种于已备好的培养基中。
此项工作叫做外植体的接种。消毒后的植物材料，(外植体)放入培养基上，要求在完全无菌的条件下进行，操作必须熟练，才能避免污染。 苗的分化培养基采用加有BA2毫克／升+NAA0.2毫克／升的MS培养基，蔗糖3％，琼脂0.8％。接种后置于培养室，培养温度25℃左右，每日光照12小时，光强度l500～2000勒克斯。接种后腋芽很快萌发，1个月以后能长成带4～6片叶，高3～5厘米的苗，叶片长3～5厘米，宽l5～2厘米，深绿色，有光泽，含有银白色胶丝。节粗壮，节间明显，腋芽发育正常，也就是说苗的腋生分枝多。将顶芽(带有2～3片小叶)或腋生分枝的芽(带有2～3片小叶)剪下，转接到新鲜的分化培养基中，1个月以后又能长出新苗，有时基部还长出丛生苗，生长分化情况良好。
观察中发现，若BA浓度超过3毫克／升，则叶片成细线形(仅宽2～3毫米，长10～15毫米)，茎极短，叶呈丛生状，生长表现为抑制状态。所以要培养出又多又健壮的苗，BA浓度以2毫克／升为好。生根培养使用的培养基是1/2MS(大量元素减半)＋IBA1.5毫克／升＋活性炭0.2克，蔗糖为2％的固体培养基。培养条件同苗的分化培养。将带有3～4片叶的苗转接到上述生根培养基中，经10～20天的培养，能长出粗壮的根。但在固体培养基中不发生根毛，只有当它伸出固体培养基，暴露于空气之中，粗壮根的前端才迅速长根毛。这样的完整植株即可移栽到土壤中。移栽方法是：
先将三角瓶里生根正常的小植株，揭开瓶塞，锻炼2～3天，使它适应外界环境，然后出瓶，洗净根系中的培养基，栽植于直径5～8厘米的培养钵内，基质为草炭土加砂(体积比为3：1)。栽植后，浇透水(用喷壶)；盖上塑料布保湿、保温，也可放在全光喷雾扦插苗床上养护。在10天以后，可以揭开塑料布，或从全光喷雾扦插苗床上取出置于阴凉处，大约1周后，移往向阳处精心管理，1个月以后生长旺盛，可换入直径为12厘米的泥盆养护，其管理方法同播种苗。
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